利用Rosetta进行蛋白质柔性对接

1. 基本原理与流程

以Local Docking为例，Rosetta将初始结构中配体与受体两者拉开一定距离后，将配体随机旋转与平移特定角度/距离后再逐步靠近受体形成复合物，并评价结合的稳定性。Rosetta实现Local Docking具有较高的精度，但很大程度上依赖于提供的初始结构，一般要求受配体的结合位点方向相对。并保持距离在10 $\mathrm{\AA }$$\mathrm{\AA}$ 以内。

考虑到结合过程中受配体会发生一定的柔性变化，在对接之前，分别对受配体进行relax以生成多种构象（ensemble），并以此进行对接，从而反映对接过程中的构象可变性。一般情况下，我们仅对侧链进行relax而保持骨架结构基本不变。

因此，Rosetta中进行蛋白-蛋白柔性对接的基本流程为：

1. 输入结构准备：受体PDB文件（R.PDB）、配体PDB文件（L.PDB）、初猜复合体结构（complex.PDB）
2. relax分别生成受体、配体的ensemble
3. 进行Local Docking
4. 分析结果，寻找最优结构

Rosetta子程序使用命令行调用时，为了方便，可以将输入的参数汇总在一个flag文件中输入

本文的例程中包括：

12
1
├── flag
2
│   ├── docking_flag
3
│   ├── docking_prepack_flag
4
│   ├── relax_flag_ChainL
5
│   └── relax_flag_ChainR
6
├── input
7
│   ├── R.pdb
8
│   ├── L.pdb
9
│   └── complex.pdb
10
└── sh
11
    ├── dock.sh
12
    └── relax.sh

其中：

• flag目录下包括输入参数（Flag）文件
• input目录下包括三个输入PDB结构文件
• sh目录包括运行脚本文件

所调用的Rosetta子程序一般位于Rosetta安装目录下的：source/bin/。为了方便，这里在~/.bashrc中加入环境变量：

1
1
export RosettaHOME=xxx/xxx/source/bin #xxx/xxx为Rosetta的安装目录

2. 输入结构准备

需要准备三个初始结构文件：

• 受体PDB文件（R.PDB）
• 配体PDB文件（L.PDB）
• 初猜的符合体结构PDB文件（complex.PDB），即将受体与配体的结合位点相对放置，并保持距离在10 $\mathrm{\AA }$$\mathrm{\AA}$ 以内

同时需要注意：

• 三个文件中的链名称应对应一致；即complex.PDB中各条链的名称与R.PDB， L.PDB中的一致
• 受体或则配体PDB文件中可以包含多条链；在complex.PDB中受体和配体的多条链应连续出现在一起（如配体为BC，受体为DA，则允许出现的顺序为BCDA或DABC）
• 尽量去除除蛋白分子外的其他分子，或去除对于Binding没有影响的Domain
• complex.PDB与R.PDB+L.PDB的总原子数、残基数保持绝对一致

3. Relax生成不同构象

3.1 参数文件准备

本例中使用的参数文件为flag/relax_flag_ChainL和flag/relax_flag_ChainR，分别用于配体、受体的relax运行

以flag/relax_flag_ChainL为例，文件内容如下：

17
1
-nstruct 35
2

3
-in:file:s ../input/L.pdb
4

5
-relax:constrain_relax_to_start_coords
6
-relax:ramp_constraints false
7

8
-ex1
9
-ex2
10

11
-use_input_sc
12
-flip_HNQ
13
-no_optH false
14

15
-relax:default_repeats 5
16
-out:path:pdb ./PDB_output/ChainL
17
-out:path:score ./score_output/ChainL

其中关键参数：

• -nstruct：生成多少个relax结构，一般大于25
• -in:file:s：输入的PDB文件路径
• -relax:constrain_relax_to_start_coords：保持骨架链不变
• -flip_HNQ：考虑H、N、Q三种残基环的翻转
• -no_optH：是否优化H（false为优化）
• -relax:default_repeats：每个输出结构重复relax的次数
• -out:path:pdb：输出PDB的路径
• -out:path:score：输出评分的路径

3.2 运行relax

进行relax的子程序名称为relax.xxx.xxx，如本例中为$RosettaHOME/relax.static.linuxgccrelease。调用时，使用@标签传入flag文件

这里使用自动化脚本运行两者的relax，存放于sh/relax.sh

89
1
# ! bin/bash
2
# Using "nohup sh sh/relax.sh &"
3

4
touch ./nohup.out
5
cat /dev/null > ./nohup.out
6
echo
7

8
rm -rf relax
9
mkdir relax
10

11
#Generate Log Files
12
touch relax/LOG.log
13

14
echo -e "\n ###################\n\n" >>  ./nohup.out
15
echo -e "\n\nStart From:" >> ./nohup.out
16
date >> ./nohup.out
17
echo -e "\n\n"  >> ./nohup.out
18

19
#####################
20
# Entering 'relax'
21
#####################
22
cd ./relax
23

24
rm -rf PDB_output
25
rm -rf score_output
26

27

28
mkdir PDB_output
29
mkdir PDB_output/ChainL
30
mkdir PDB_output/ChainR
31

32
mkdir score_output
33
mkdir score_output/ChainL
34
mkdir score_output/ChainR
35
 
36
#Run relax of L.PDB
37
$RosettaHOME/relax.static.linuxgccrelease @../flag/relax_flag_ChainL
38

39
echo -e "\n\n#############\n\nChainL Done: " >> ../nohup.out
40
date >> ../nohup.out
41
echo -e "\n\n#############\n\n" >> ../nohup.out
42

43
#Run relax of R.PDB
44
$RosettaHOME/relax.static.linuxgccrelease @../flag/relax_flag_ChainR
45

46

47
cd ../
48
#####################
49
# Exit 'relax'
50
#####################
51
echo -e "\n\nChainR Done:" >> ./nohup.out
52
date >> ./nohup.out
53

54
echo -e "\n\nALL THE RELAX DONE\n\n" >>  ./nohup.out
55
echo -e "\n\n######################\n\n" >> ./nohup.out
56

57
###########
58
Generate list of ensemble files
59
###########
60
#! bin/bash
61

62
cd relax/PDB_output/ChainL
63
rm -f ensemble.list
64
filelist1=""
65
for file in `ls`
66
    do
67
    filename=`realpath $file`
68
    filelist1=$filelist1"\n"$filename
69
    done
70
echo "$filelist1" > ensemble.list
71
cd ../../../
72

73
cd relax/PDB_output/ChainR
74
rm -f ensemble.list
75
filelist2=""
76
for file in `ls`
77
    do
78
    filename=`realpath $file`
79
    filelist2=$filelist2"\n"$filename
80
    done
81
echo "$filelist2" > ensemble.list
82
cd ../../../
83

84

85
cat ./nohup.out > relax/LOG.log
86
cat /dev/null > ./nohup.out
87

88
rm -rf relax/PDB_output_backup
89
cp -r relax/PDB_output relax/PDB_output_backup

运行后生成了不同结构的评分（位于./relax/score_output），不同relax后的PDB结构（./relax/PDB_output），以及ensemble.list文件，包含了每条链下每个relax输出结果的绝对路径。

4. 使用不同构象集进行Docking

4.1 参数文件准备

用于Local Docking的参数文件为flag/docking_prepack_flag和flag/docking_prepack_flag，分别为用于预处理（打包ensemble文件）和运行Docking

其中flag/docking_flag如下：

15
1
-in:file:s ../input/complex.pdb
2

3
-nstruct 1250
4

5
-partners D_M
6
-dock_pert 1 4
7

8
-ensemble1 ../relax/PDB_output/ChainR/ensemble.list
9
-ensemble2 ../relax/PDB_output/ChainL/ensemble.list
10

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-ex1
12
-ex2aro
13

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-out:path:all ./output
15
-out:suffix _ensemble_docking

其中关键参数：

• -nstruct：生成多少个Docking结构，一般大于500
• -in:file:s：输入的PDB文件路径
• -partner：指定参与对接的受体、配体的链编号；下划线_分割受体和配体
• -ensemble1和-ensemble2：指定输入受体、配体构象集的ensemble.list的路径
• -out:path:all：输出结果的路径

需要注意，-partner指定的链的顺序必须和complex.PDB文件中链出现的顺序一致，且与ensemble参数的声明顺序一致，如：

若complex.PDB中链出现顺序为B,C,D,A，其中B,C属于配体，则在L.PDB中出现的顺序也应为B,C；D,A属于受体，则在R.PDB中出现的顺序也应为D,A；由于BC先于DA出现，则应声明-partner BC_DA；且-ensemble1应对应于先出现的BC的L.PDB，-ensemble2对应于后出现的DA的R.PDB

4.2 运行Docking

Prepacking和Local Docking所使用的子程序分别为docking_prepack_protocol.xxx.xxx和docking_protocol.xxx.xxx，如本例中分别为$RosettaHOME/docking_prepack_protocol.static.linuxgccrelease和$RosettaHOME/docking_protocol.static.linuxgccrelease

批量运行的脚本sh/dock.sh如下

44
1
# ! bin/bash
2
# Using "nohup sh sh/dock.sh &"
3

4
touch ./nohup.out
5
cat /dev/null > ./nohup.out
6
echo
7

8
rm -rf docking
9
mkdir docking
10

11
#Generate Log Files
12
touch docking/LOG.log
13

14
echo -e "\n ###################\n\n" >>  ./nohup.out
15
echo -e "\n\nStart From:" >> ./nohup.out
16
date >> ./nohup.out
17
echo -e "\n\n"  >> ./nohup.out
18

19
#####################
20
# Entering 'docking'
21
#####################
22
cd ./docking
23

24
rm -rf output
25
mkdir output
26

27
#input中链出现的顺序应与ensemble1到ensemble2的顺序一致，并与-partners 声明顺序一致
28

29
$RosettaHOME/docking_prepack_protocol.static.linuxgccrelease @../flag/docking_prepack_flag
30

31
$RosettaHOME/docking_protocol.static.linuxgccrelease @../flag/docking_flag
32

33
cd ../
34
#####################
35
# Exit 'docking'
36
#####################
37
echo -e "To:" >> ./nohup.out
38
date >> ./nohup.out
39

40
echo -e "\n\nALL THE RELAX DONE\n\n" >>  ./nohup.out
41
echo -e "\n\n######################\n\n" >> ./nohup.out
42

43
cat ./nohup.out > docking/LOG.log
44
cat /dev/null > ./nohup.out

prepacking后，原始的ensemble目录下会生成.ppk文件；运行Docking后，其结果可在工作目录下的./docking/output中找到，包括生成的对接后PDB结构文件和评分文件score_ensemble_docking.sc

5. 结果分析

一般而言，总评分越小（一般为负值），对接效果越好。选取评分最小的多个PDB文件，查看其结构合理性。对于对接后的结构，可以进一步采用能量最小化等方法进行局部优化，排除不合理的原子接触。

示例脚本sh/rank.sh 提供了一个用于按照SCORE排序，并将前10个结果单独复制至docking/output/top

25
1
#!/bin/bash
2

3
cd docking/output
4

5
rm -rf top
6
mkdir top
7

8
#使用排名前几的结构
9
TopRank=10
10

11
# 创建一个临时文件来存储排名前10的信息
12
touch top/rank.sc
13
touch top/toprank.sc
14

15
# 提取排名和分数信息，排序并输出前10个到临时文件
16
awk 'NR > 2 {print $2, $40}' score_ensemble_docking.sc | sort -k1,1n -r -t " " > top/rank.sc
17
head -n $TopRank top/rank.sc> top/toprank.sc
18

19
# 读取临时文件中的文件名并复制对应的文件到top目录，并进行重命名
20
rank=1
21
while read -r score origin_filename; do
22
  new_filename="${rank}_${score}.pdb"
23
  cp "${origin_filename}.pdb" "top/${new_filename}"
24
  rank=$(($rank+1))
25
done < top/toprank.sc

附：脚本和参数文件

RosettaDocking_demo